Doble-stranded RNA (dsRNA) ELISA KIT

Kini nga kit kay Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) nga gidugtong sa biotin-Streptavidin system, para sa quantitative measurement sa dsRNA nga adunay gitas-on nga labaw sa 60 base pairs(bp), bisan unsa pa ang pagkasunodsunod.Ang plato na pre-coated sa anti-dsRNA antibody.Ang dsRNA nga naa sa sample gidugang ug nagbugkos sa mga antibodies nga giputos sa mga atabay.Ug dayon gidugang ang biotinylated anti-dsRNA antibody ug gigapos sa dsRNA sa sample.Human sa paghugas, ang HRP-Streptavidin gidugang ug gigapos sa Biotinylated anti-dsRNA antibody.Pagkahuman sa paglumlum, ang HRP-Streptavidin nahugasan.Dayon ang TMB substrate solution idugang ug gi-catalyzed sa HRP aron makagama og asul nga kolor nga produkto nga nausab ngadto sa yellow human sa pagdugang sa acidic stop solution.Ang densidad sa yellow kay proporsyonal sa target nga kantidad sa dsRNA nga nakuha sa plato.Ang absorbance gisukod sa 450 nm.

Aplikasyon

Kini nga kit kay para sa quantitative measurement sa nahabilin nga dsRNA.

Mga sangkap sa kit

Pagtipig ug Kalig-on

1. Alang sa wala magamit nga kit: Ang tibuok kit mahimong tipigan sa 2 ~ 8 ℃ sa estante sa kinabuhi.Ang kusog nga kahayag kinahanglan likayan alang sa kalig-on sa pagtipig.

2. Alang sa gigamit nga kit: Sa higayon nga maablihan ang microplate, palihug tabuni ang wala magamit nga mga atabay sa plate sealer ug ibalik sa foil pouch nga adunay sulod nga desiccant pack, zip-seal ang foil pouch ug ibalik sa 2 ~ 8 ℃ sa labing madali human sa paggamit.Ang ubang mga reagents kinahanglan nga ibalik ngadto sa 2 ~ 8 ℃ sa diha nga mahimo human sa paggamit.

Mga Materyal nga Gikinahanglan Apan Dili Gihatag

1. Microplate reader nga adunay 450±10nm filter (mas maayo kon makamatikod sa 450 ug 650 nm wavelength).

2. Microplate shaker.

3. RNase-free tips ug centrifuge tubes.

Flowchart sa Operasyon

Sa Dili Ka pa Magsugod

1. Dad-a ang tanang sangkap sa kit ug mga sample sa temperatura sa lawak (18-25 ℃) sa dili pa gamiton.Kung ang kit dili magamit sa usa ka higayon, palihug kuhaa lamang ang mga strips ug reagents alang sa karon nga eksperimento, ug ibilin ang nahabilin nga mga strips ug reagents sa gikinahanglan nga kondisyon.

2. Hugasan nga buffer: dilute ang 40mL sa 20x concentrated wash buffer nga adunay 760mL nga deionized o distilled nga tubig aron maandam ang 800mL nga 1x wash buffer.

3. Standard: sa makadiyot spin o centrifuge ang stock solution sa dili pa gamiton.Ang konsentrasyon sa upat ka mga sumbanan nga gihatag mao ang 5ng/μL.Para sa UTP ug pUTP dsRNA standards, palihog dilute ang stock solution ngadto sa 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg/μL gamit ang STE buffer para madrowing ang standard curve.Para sa N1-Me-pUTP dsRNA standards, palihog dilute ang stock solution sa 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg/μL nga may STE buffer para madrowing ang standard curve.Para sa 5-OMe-UTP dsRNA standard, palihog dilute ang stock solution sa 4,2,1,0.5, 0.25,0.125,0.0625, 0pg/μL nga may STE buffer para madrowing ang standard curve.Among girekomendar ang mga sumbanan mahimong lasaw sama sa mosunod nga mga tsart:

4. Biotinylated detection antibody ug HRP-streptavidin working solution: kadiyot spin o centrifuge ang stock solution sa dili pa gamiton.Dilute sila sa nagtrabaho nga konsentrasyon nga adunay dilution buffer.

5. TMB substate: aspirate ang gikinahanglan nga dosis sa solusyon gamit ang sterilized tips ug ayaw ihulog ang nahabilin nga solusyon sa vial pag-usab.Ang TMB substate sensitibo sa kahayag, ayaw ibutang ang TMB substrate sa kahayag sa dugay nga panahon.

Paggamit sa protocol

1. Tinoa ang gidaghanon sa mga strips nga gikinahanglan alang sa assay.Isulod ang mga strips sa mga frame para gamiton.Ang nahabilin nga mga piraso sa plato nga wala gigamit sa kini nga pagsulay kinahanglan nga ibutang pag-usab sa bag nga adunay desiccant.Isira pag-ayo ang bag para sa refrigerated storage.

2. Idugang ang 100μL matag usa sa mga dilution sa standard, blangko ug mga sample ngadto sa angay nga mga atabay.Tabuni gamit ang plate sealer.Paglumlom sa 1 ka oras sa temperatura sa kwarto nga adunay pag-uyog sa 500rpm.Ang mga sampol kinahanglan nga lasaw sa STE buffer sa angay nga konsentrasyon alang sa tukma nga pagsulay.

3. Lakang sa paghugas: Aspirate ang solusyon ug hugasi gamit ang 250μL wash buffer sa matag atabay ug pabarug kini sulod sa 30s.Isalikway ang wash buffer sa hingpit pinaagi sa pag-snap sa plato sa absorbent nga papel.Paghugas sa hingpit 4 ka beses.

4. Idugang ang 100μL nga biotinylated detection antibody working solution sa matag atabay.Tabuni gamit ang plate sealer.Paglumlom sa 1 ka oras sa temperatura sa kwarto nga adunay pag-uyog sa 500rpm.

5. Balika ang lakang sa paghugas.

6. Idugang ang 100μL sa HRP-streptavidin working solution sa matag atabay.Tabuni gamit ang plate sealer.Paglumlom sa 30min sa temperatura sa kwarto nga adunay pag-uyog sa 500rpm.

7. Balika pag-usab ang lakang sa paghugas.

8. Idugang ang 100μL nga TMB substrate solution sa matag atabay.Tabuni gamit ang plate sealer.Paglumlom sa 30 min sa RT Protect gikan sa kahayag.Ang likido mahimong asul pinaagi sa pagdugang sa solusyon sa substrate.

9. Idugang ang 50μL nga stop solution sa matag atabay.Ang likido mahimong dilaw pinaagi sa pagdugang sa stop solution.Dayon padagana ang microplate reader ug ipahigayon dayon ang pagsukod sa 450nm.

Pagkalkula sa mga Resulta

1. I-average ang mga duplicate nga pagbasa para sa matag standard, control, ug sample ug ibawas ang average nga zero standard optical density.Paghimo ug standard curve nga adunay absorbance sa vertical(Y) axis ug dsRNA concentration sa horizontal(X) axis.

2. Girekomendar nga himoon ang kalkulasyon gamit ang computer-based curve-fitting software sama sa curve expert 1.3 o ELISA Calc sa 5 o 4 parameter non-linear fit model.

Pagpasundayag

1. Pagkasensitibo:

ubos nga limitasyon sa detection: ≤ 0.001pg/μL (alang sa UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0.01pg/μL (alang sa 5-OMe-UTP-dsRNA).

ubos nga limitasyon sa quantitation:0.0156 pg/μL (alang sa UTP-, pUTP-dsRNA),0.0312 pg/μL (alang sa N1-Me-pUTP-dsRNA),0.0625 pg/μL (alang sa 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. Precision: CV sa Intra-Assay ≤10%, CV sa Inter-Assay ≤10%

3. Pagbawi: 80%~120%

4.Linearity:0.0156-0.5pg/μL(forUTP-,pUTP-dsRNA)0.0312-1pg/μL(forN1-Me-pUTP dsRNA),0.0625-1pg/μL(para sa 5-OMe-UTP-dsRNA).

Mga konsiderasyon

1. Ang temperatura ug oras sa reaksyon sa TMB kritikal, palihug kontrola sila sumala sa estrikto nga panudlo.

2. Aron makab-ot ang maayo nga assay reproducibility ug sensitivity, ang hustong paghugas sa mga plato aron makuha ang sobra nga un-reacted reagents kinahanglanon.

3. Ang tanan nga mga reagents kinahanglan nga isagol nga maayo sa dili pa gamiton ug likayan ang mga bumbled sa panahon sa sample o pagdugang sa mga reagents.

4. Kung naporma ang mga kristal sa concentrated wash buffer(20x), init ngadto sa 37 ℃ ug hinayhinay nga sagol hangtud nga ang mga kristal hingpit nga matunaw.

5. Likayi ang pagsulay sa mga sample nga adunay Sodium Azide (NaN3), tungod kay kini makaguba sa HRP nga kalihokan nga moresulta sa ubos nga pagtantiya sa gidaghanon sa dsRNA.

6. Likayi ang kontaminasyon sa RNase sa panahon sa pagsulay.

7. Ang standard/sample, detection antibody ug SA-HRP mahimo usab nga ipahigayon sa RT nga walay pag-uyog, apan kini mahimong hinungdan sa detection sensitivity nga pagkunhod sa usa ka pilo.Alang niini nga kaso, among girekomendar ang UTP ug pUTP dsRNA standards kinahanglan nga lasaw gikan sa 2pg/μL, N1-Me-pUTP dsRNA standards kinahanglan nga lasaw gikan sa 4pg/μL ug 5-OMe-UTP dsRNA standard kinahanglan nga lasaw gikan sa 8pg/μL.Dugang pa, paglumlum sa HRP-streptavidin nga solusyon sa pagtrabaho alang sa 60min sa temperatura sa kwarto.Ayaw gamita ang flask shaker, tungod kay ang flask shaker mahimong moresulta sa dili tukma nga resulta.

Kinaandan nga resulta

1. Standard curve data

2. Pagkalkula sa standard curve

3. Liner detection range: 0.0312- 1pg/μL