mRNA Cap2'-O-Methyltransferase

Ang mRNA Cap 2' -O-methyltransferase nakuha gikan sa usa ka recombinant E. coli strain nga nagdala sa gene alang sa vaccinia mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase.Kini nga enzyme nagdugang ug methyl group sa 2'-O nga posisyon sa unang nucleotide nga tapad sa cap structure sa 5'end sa RNA. Ang enzyme naggamit sa S-adenosylmethionine (SAM) isip methyl donor sa methylate cap nga RNA (cap) -0) nga miresulta sa usa ka cap- 1 nga istruktura.

Ang Cap1 nga istruktura makadugang sa kahusayan sa paghubad, pagpaayo sa ekspresyon sa mRNA sa transfection ug microinjection nga mga eksperimento.Kini nga enzyme espesipikong nagkinahanglan sa RNA nga adunay m7GpppN cap isip substrate.Dili kini makagamit sa RNA nga adunay pN, ppN, pppN o GpppN sa 5' katapusan.Ang cap nga RNA mahimong andamon pinaagi sa in vitro transcription gamit ang cap analog o pinaagi sa enzymatic capping gamit ang Vaccinia Capping Enzyme.

Mga sangkap

mRNA Cap 2'-O-Methyltransferase (50U/μL)

10×Capping Reaction Buffer

Pagtipig

-25 ～- 15 ℃ alang sa pagtipig （ Likayi ang balik-balik nga mga siklo sa pag-freeze-thaw）

Pagtipig buffer

20 mM Tris-HCl（pH 8.0，25℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0. 1 mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100， 50% glycerol.

Kahubitan sa yunit

Ang usa ka yunit gihubit isip ang gidaghanon sa enzyme nga gikinahanglan sa methylate 10 pmoles sa 80 nt cap nga RNA transcript sa 1 ka oras sa 37°C.

Mga pagsulay sa pagkontrol sa kalidad

Exonuclease:50U sa mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase nga adunay 1μg λ-Hind III nga paghilis sa DNA sa 37 ℃ sulod sa 16 ka oras wala maghatag ug degradasyon sumala sa gitino sa agarose gel electrophoresis.

Endonuclease: 50 U sa mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase nga adunay 1 μg λDNA sa 37 ℃ sulod sa 16 ka oras dili makahatag ug degradasyon nga gitino sa agarose gel electrophoresis.

Nickase: 50U sa mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase nga adunay 1μg pBR322 sa 37 ℃ sulod sa 16 ka oras wala maghatag ug degradasyon nga gitino sa agarose gel electrophoresis.

RNase: 50U sa mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase nga adunay 1.6μg MS2 RNA sulod sa 4 ka oras sa 37 ℃ dili makahatag ug degradasyon nga gitino sa agarose gel electrophoresis.

E. coli DNA: 50U sa mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferase gisusi alang sa presensya saE. coli genomic DNA gamit ang TaqMan qPCR nga adunay mga primer nga espesipiko alang saE. coli 16S rRNA nga dapit.AngE. coli Ang kontaminasyon sa genomic DNA mao ang =1E. coli genome.

Bakterya Endotoxin: LAL-test, sumala sa Chinese Pharmacopoeia IV 2020 nga edisyon, gel limit test method, general rule (1143).Ang sulud sa bakterya nga endotoxin kinahanglan nga = 10 EU / mg.

Sistema sa reaksyon ug kondisyon

1. Isagol ang angay nga kantidad sa Capped RNA ug RNase-free H2O sa 1.5 mL microfuge tube ngadto sa katapusang volume nga 16.0 µL.

2. Pag-init sa 65 ℃ sulod sa 5 ka minuto nga gisundan sa usa ka ice-bath sulod sa 5 ka minuto.

3. Idugang ang mosunod nga mga sangkap sa han-ay nga gitakda (alang sa methylation sa Capped RNA

ubos sa 10

*10× Capping Reaction Buffer : 500 mM Tris-HCl(pH 8.0, 25 ℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2 , 10 mM DTT.

4. Paglumlum sa 37 ℃ sulod sa 1 ka oras (2 ka oras nga paglumlum girekomendar alang sa target nga tipik nga ubos sa 200 nt).

Mga aplikasyon

Aron mapauswag ang ekspresyon sa mRNA sa panahon sa mga eksperimento sa microinjection ug transfection.

Mga nota sa paggamit

1. Sa dili pa ang reaksyon, ang RNA kinahanglan nga putli ug dissolved sa nuclease-free nga tubig, ang tanan nga mga solusyon kinahanglan nga walay bisan unsa nga EDTA ug ions.

2. Girekomenda nga ipainit ang sample RNA sa 65 ℃ sulod sa 5 min sa dili pa ang reaksyon aron makuha ang sekondaryang istruktura sa 5'end sa transcript.Mahimo kini nga lugwayan ngadto sa 10 min alang sa komplikadong 5′-terminal nga estraktura.