PNGase F
Ang Peptide-N-Glycosidase F(PNGase F) mao ang labing epektibo nga enzymatic nga pamaagi sa pagtangtang sa halos tanang N-linked oligosaccharides gikan sa glycoproteins.Ang PNGase F kay usa ka amidase, nga nagbuy-od tali sa sulod nga kadaghanan sa GlcNAc ug asparagine residues sa taas nga mannose, hybrid, ug complex oligosaccharides gikan sa N-linked glycoproteins.
Aplikasyon
Kini nga enzyme mapuslanon alang sa pagtangtang sa mga residu sa carbohydrate gikan sa mga protina.
Pagpangandam ug espesipikasyon
Panagway | Walay Kolor nga Liquid |
Pagkaputli sa protina | ≥95% (gikan sa SDS-PAGE) |
Kalihokan | ≥500,000 U/mL |
Exoglycosidase | Walay kalihokan nga mamatikdan (ND) |
Endoglycosidase F1 | ND |
Endoglycosidase F2 | ND |
Endoglycosidase F3 | ND |
Endoglycosidase H | ND |
Protease | ND |
Mga kabtangan
Numero sa EC | 3.5.1.52(Recombinant gikan sa microorganism) |
Molekular nga gibug-aton | 35 kDa (SDS-PAGE) |
Isoelektrik nga punto | 8. 14 |
Labing maayo nga pH | 7.0-8.0 |
Labing maayo nga temperatura | 65 °C |
Espesipiko sa substrate | Pagputol sa glycosidic bonds tali sa GlcNAc ug asparagine residues Fig.1 |
Mga dapit sa pag-ila | N-linked glycans gawas kon adunay α1-3 fucose Fig. 2 |
Mga activator | DTT |
Inhibitor | SDS |
Temperatura sa pagtipig | -25 ~-15 ℃ |
Pagka-Inactivation sa Kainit | Ang usa ka 20µL reaction mixture nga adunay sulod nga 1µL sa PNGase F gi-inactivate pinaagi sa paglumlum sa 75 °C sulod sa 10 minutos. |
Fig. 1 Substrate specificity sa PNGase F
Fig. 2 Recognition naglingkod sa PNGase F.
Kung ang internal nga mga residu sa GlcNAc nalambigit sa α1-3 fucose, ang PNGase F dili makabulag sa N-linked oligosaccharides gikan sa glycoproteins.Kini nga pagbag-o kasagaran sa mga tanum ug pipila ka mga glycoprotein sa insekto.
Cmga omponent
| Mga sangkap | Konsentrasyon |
1 | PNGase F | 50 µl |
2 | 10 × Glycoprotein Denaturing Buffer | 1000 µl |
3 | 10×GlycoBuffer 2 | 1000 µl |
4 | 10% NP-40 | 1000 µl |
Kahubitan sa yunit
Ang usa ka yunit(U) gihubit isip ang gidaghanon sa enzyme nga gikinahanglan aron makuha ang>95% sa carbohydrate gikan sa 10 µg sa denatured RNase B sulod sa 1 ka oras sa 37°C sa kinatibuk-ang gidaghanon sa reaksyon nga 10 µL.
Mga kondisyon sa reaksyon
1. Dissolve 1-20 µg sa glycoprotein uban sa deionized tubig, idugang 1 µl 10×Glycoprotein Denaturing Buffer ug H2O (kon gikinahanglan) sa paghimo sa usa ka 10 µl kinatibuk-ang gidaghanon sa reaksyon.
2.Paglumlum sa 100 ° C sulod sa 10 min, pabugnawa kini sa yelo.
3.Idugang ang 2 µl 10×GlycoBuffer 2, 2 µl 10% NP-40 ug isagol.
4.Idugang ang 1-2 µl PNGase F ug H2O (kon gikinahanglan) sa paghimo sa usa ka 20 µl kinatibuk-ang gidaghanon sa reaksyon ug mix.
5.Paglumlom sa reaksyon sa 37 ° C sulod sa 60 min.
6.Para sa SDS-PAGE analysis o HPLC analysis.