RTL Reverse Transcriptase
Ang RTL reverse transcriptase usa ka RNA template-dependent nga DNA polymerase nga kulang sa 3'→5' exonuclease nga kalihokan ug adunay RNase H nga kalihokan.Mahimong gamiton niini nga enzyme ang RNA isip template sa pag-synthesize og complementary strand sa DNA, nga mahimong magamit sa first-strand cDNA synthesis, ilabi na sa RT-LAMP (loop-mediated isothermal amplification).Kung itandi sa RTL reverse transcriptase 1.0, ang pagkasensitibo labi nga gipauswag, ang kalig-on sa thermal mas lig-on, ug ang reaksyon sa 65 ° C mas lig-on.RTL reverse transcriptase (glycerol free) mahimong gamiton sa pag-andam sa lyophilized nga mga pagpangandam, lyophilized RT-LAMP reagents ug uban pa.
Kahubitan sa Yunit
Ang usa ka yunit naglakip sa 1 nmol sa dTTP ngadto sa acid-precipitable nga materyal sulod sa 20 minutos sa 50°C gamit ang poly(A)•oligo(dT)25 isip template-primer.
Mga sangkap
| Component | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL Reverse Transcriptase (Glycerol-free) (15U/μL) | 0.1 mL | 1 mL | 10 mL |
| 10×HC RTL Buffer | 1.5 mL | 4 × 1.5 mL | 5 × 10 mL |
| MgSO4 (100mM) | 1.5 mL | 2 × 1.5 mL | 3 × 10 mL |
Kondisyon sa Pagtipig
Transportasyon ubos sa 0°C ug tipigan sa -25°C~-15°C.
Pagkontrol sa Kalidad
- Nabilin nga Kalihokan saEndonuclease:Usa ka 50 μL nga reaksyon nga adunay sulod nga 1 μg sa λDNA ug 15 ka yunit sa RTL2.0 nga gilumlum sulod sa 16 ka oras sa 37 ℃ nagpakita sa samang sumbanan sama sa negatibong kontrol sa gel electrophoresis.
- Nabilin nga Kalihokan saExonuclease:Usa ka 50 μL nga reaksyon nga adunay sulod nga 1 μg sa Hind Ⅲ digested λDNA ug 15 ka yunit sa RTL2.0 nga gilumlum sulod sa 16 ka oras sa 37 ℃ nagpakita sa sama nga sumbanan sama sa negatibo nga kontrol sa gel electrophoresis.
- Nabilin nga Kalihokan saNickase:Ang 50 μL nga reaksyon nga adunay 1 μg nga supercoiled pBR322 ug 15 nga mga yunit sa RTL2.0 nga gilumlum sulod sa 4 ka oras sa 37 ° C nagpakita sa sama nga sumbanan sama sa negatibo nga kontrol sa gel electrophoresis.
- Nabilin nga Kalihokan saRNase:Ang usa ka 10 μL nga reaksyon nga adunay sulod nga 0.48 μg sa MS2 RNA ug 15 nga mga yunit sa RTL2.0 nga gilumlum sulod sa 4 ka oras sa 37 ° C nagpakita sa sama nga sumbanan sama sa negatibo nga pagkontrol sa gel electrophoresis.
- E. coli gDNA:Gisukod saE.coliespesipikong HCD detection kits，15 units sa RTL2.0 adunay ubos sa 1E. coligenome.
Setup sa Reaksyon
cDNA Synthesis Protocol
| Mga sangkap | Tomo |
| Template RNA a | kapilian |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) o Random Primer mix(60uM) | 2 μL |
| dNTP Mix (10mM matag usa) | 1 μL |
| RNase Inhibitor (40U/uL) | 0.5 μL |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/uL) | 0.5 μL |
| 10×HC RTL Buffer | 2 μL |
| Tubig nga walay Nuclease | Hangtod sa 20 μL |
Mubo nga sulat:
1) Ang girekomendar nga dosis sa Total RNA mao ang 1ng~1μg
2) Ang girekomendar nga dosis sa mRNA kay 50ng~100ng
Thermo-pagbisikleta Kondisyon alang sa usa ka rutina reaksyon:
| Temperatura (°C) | Panahon |
| 25 °Ca | 5mins |
| 55 °C | 10 minb |
| 80 °C | 10 min |
Mubo nga sulat:
1) Kung Random Primer Mix ang gigamit, usa ka lakang sa paglumlum sa 25 ° C.
2) Kung gigamit ang target nga primer mix, usa ka lakang sa paglumlum sa 55 ° C alang sa 10 ~ 30mins.
RT-LAMP Protocol
| Mga sangkap | Tomo | Katapusan nga Konsentrasyon |
| Template RNA | kapilian | ≥10 ka kopya |
| dNTP Mix (10mM) | 3.5 μL | 1.4 mM |
| FIP/BIP Primer (25×) | 1 μL | 1.6 μM |
| F3/B3 Primer (25×) | 1 μL | 0.2 μM |
| LoopF/LoopB Primer (25×) | 1 μL | 0.4 μM |
| RNase Inhibitor (40U/μL) | 0.5 μL | 20 U/Reaksyon |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/μL) | 0.5 μL | 7.5 U/Reaksyon |
| Bst V2 DNA Polymerase (8U/μL) | 1 μL | 8 U/Reaksyon |
| MgSO4 (100mM) | 1.5 μL | 6 mM (Total 8 mM) |
| 10×HC RTL Buffer (o 10×HC Bst V2 Buffer) | 2.5 μL | 1 × (2mM Mg2+) |
| Tubig nga walay Nuclease | Hangtod sa 25 μL | - |
Mubo nga sulat:
1) Pagsagol pinaagi sa vortexing ug centrifuge sa makadiyot aron makolekta.Kanunay nga paglumlum sa temperatura sa 65 ° C sulod sa 1 ka oras.
2) Ang duha ka buffer interoperable ug adunay parehas nga komposisyon.
Mga nota
1.Kini nga produkto mahimong usa ka puti nga solid kung gitipigan sa -20 °C.Kuhaa kini gikan sa -20°C ug ibutang kini sa yelo sulod sa mga 10 minutos.Human sa pagtunaw, kini mahimong gamiton pinaagi sa pag-uyog ug pagsagol.
2. Ang produkto sa cDNA mahimong tipigan sa -20°C o -80°C o gamiton dayon alang sa reaksyon sa PCR.
3.Aron malikayan ang kontaminasyon sa RNase, palihug hupti nga limpyo ang eksperimento nga lugar, ug pagsul-ob og limpyo nga gwantes ug maskara sa panahon sa operasyon.
