Vaccinia Virus Capping Enzyme

Ang Vaccinia virus capping enzyme nakuha gikan sa usa ka recombinant E. coli strain nga nagdala sa mga gene alang sa Vaccinia capping enzyme.Kining usa ka enzyme gilangkuban sa duha ka subunits (D1 ug D12) ug adunay tulo ka enzymatic nga kalihokan (RNA triphosphatase ug guanylyltransferase sa D1 subunit ug guanine methyltransferase sa D12 subunit).Epektibo ang Vaccinia virus Capping Enzyme sa pag-catalyze sa pagporma sa cap structure, nga espesipikong makadugtong sa 7-methylguanylate cap structure (m7Gppp, Cap 0) ngadto sa 5′ end sa RNA.Ang istruktura sa cap (Cap 0) adunay hinungdanon nga papel sa pag-stabilize, transportasyon ug paghubad sa mRNA sa mga eukaryote.Ang pagtak-op sa RNA pinaagi sa enzymatic nga reaksyon usa ka epektibo ug yano nga pamaagi nga makapauswag sa kalig-on ug paghubad sa RNA alang sa in vitro transcription, transfection, ug microinjection.

Mga sangkap

Vaccinia Virus Capping Enzyme (10 U/μL)

10×Capping Buffer

Mga kahimtang sa pagtipig

-25～- 15℃ para sa pagtipig (Likayi ang balikbalik nga freeze-thaw cycles)

Pagtipig buffer

20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl,

1mM DTT, 0. 1mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100, 50% glycerol.

Kahubitan sa Yunit

Ang usa ka yunit sa Vaccinia virus Capping Enzyme gihubit isip ang gidaghanon sa enzyme nga gikinahanglan aron maapil ang 10pmol sa GTP ngadto sa 80nt transcript sa 1 ka oras sa 37°C.

Pagkontrol sa Kalidad

Exonuclease:Ang 10U sa Vaccinia virus Capping Enzyme nga adunay 1μg λ-Hind III nga paghilis sa DNA sa 37 ℃ sulod sa 16 ka oras dili makahatag ug degradasyon nga gitino sa agarose gel electrophoresis.

Endonuclease:Ang 10U sa Vaccinia virus Capping Enzyme nga adunay 1μg λDNA sa 37 ℃ sulod sa 16 ka oras wala magbunga nga pagkadaot sama sa gitino sa agarose gel electrophoresis.

Nickase:Ang 10U sa Vaccinia virus Capping Enzyme nga adunay 1 μg pBR322 sa 37 ℃ sulod sa 16 ka oras wala magbunga nga pagkadaot sumala sa gitino sa agarose gel electrophoresis.

RNase:Ang 10U sa Vaccinia virus Capping Enzyme nga adunay 1.6μg MS2 RNA sulod sa 4 ka oras sa 37 ℃ wala maghatag ug degradasyon nga gitino sa agarose gel electrophoresis.

1.coli DNA:Ang 10U sa Vaccinia virus Capping Enzyme gisusi alang sa presensya sa E. coli genomic DNA gamit ang TaqMan qPCR nga adunay mga primer nga espesipiko alang sa E. coli 16S rRNA locus.Ang E. coli genomic DNA kontaminasyon kay≤1 E. coli genome.

2.Bakterya Endotoxin: LAL-test, sumala sa Chinese Pharmacopoeia IV 2020 nga edisyon, gel limit test method, general rule (1143).Ang sulod sa bacterial endotoxin kinahanglan nga ≤10 EU/mg.

Sistema sa reaksyon ug kondisyon

1. Capping Protocol (gidaghanon sa reaksyon: 20 μL)

Ang kini nga pamaagi magamit sa reaksyon sa capping sa 10μg RNA (≥100 nt) ug mahimo kini nga mapadako sumala sa mga gipangayo sa eksperimento.

I) Combine 10μg RNA ug Nuclease-free H2O sa usa ka 1.5 ml microfuge tube ngadto sa usa ka katapusan nga gidaghanon sa 15.0 μL.*10×Capping Buffer: 0.5M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH 8.0)

2) Pag-init sa 65 ℃ sulod sa 5 minutos nga gisundan sa ice bath sulod sa 5 minutos.

3) Idugang ang mosunod nga mga sangkap sa han-ay nga gitakda

*10×Capping Buffer:0.5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH8.0)

4) I-incubate sa 37°C sulod sa 30 minutos, ang RNA karon gitakpan ug andam na alang sa downstream nga mga aplikasyon.

2. 5′ nga terminal reaksyon sa pag-label (gidaghanon sa reaksyon: 20 μL)

Kini nga protocol gidesinyo sa pag-label sa RNA nga adunay 5' triphosphate ug mahimo kini nga madugangan sumala sa gipangayo.Ang kaepektibo sa paglakip sa label maapektuhan sa molar ratio sa RNA: GTP, ingon man ang sulud sa GTP sa mga sample sa RNA.

1) Pagsagol sa angay nga gidaghanon sa RNA ug Nuclease-free H2O sa usa ka 1.5 ml nga microfuge tube ngadto sa katapusang gidaghanon nga 14.0 µL.

2) Pag-init sa 65 ℃ sulod sa 5 minutos nga gisundan sa ice bath sulod sa 5 minutos.

3) Idugang ang mosunod nga mga sangkap sa han-ay nga gitakda.

** Ang GTP MIX nagtumong sa GTP ug gamay nga gidaghanon sa mga marker.Alang sa konsentrasyon sa GTP, tan-awasa Note 3.

4) I-incubate sa 37°C sulod sa 30 minutos, ang RNA 5′ nga katapusan kay gimarkahan na ug andam na para sa downstream.

Mga aplikasyon

1. Pagtak-op sa mRNA sa wala pa ang mga pagsulay sa paghubad/in vitro nga paghubad

2. Pagmarka sa 5' katapusan sa mRNA

Mga nota sa paggamit

1.Ang pagpainit sa solusyon sa RNA sa wala pa ang paglumlum sa Vaccinia Capping Enzyme nagtangtang sa ikaduhang istruktura sa 5'katapusan sa transcript.Palawigon ang oras sa 60 minuto para sa mga transkrip nga adunay nahibal-an nga istruktura nga 5'ends.

2. Ang RNA nga gigamit alang sa mga reaksyon sa capping kinahanglan nga limpyohan sa dili pa gamiton ug masuspinde sa tubig nga walay nuclease.Ang EDTA kinahanglan dili anaa ug ang solusyon kinahanglan nga walay mga asin.

3. Alang sa pag-label sa 5' nga katapusan, ang kinatibuk-ang konsentrasyon sa GTP kinahanglan nga mga 1-3 ka pilo sa molar nga konsentrasyon sa mRNA sa reaksyon.

4. Ang gidaghanon sa sistema sa reaksyon mahimong pataas o paubos sumala sa aktuwal.