M-MLV Neoscript Reverse Transcriptase
Ang Neoscript Reverse Transcriptase usa ka reverse transcriptase nga nakuha pinaagi sa mutation screening sa M-MLV gene sa Moloney murine leukemia virus nga gigikanan ug ekspresyon sa E.coli.Gikuha sa enzyme ang kalihokan sa RNase H, adunay mas taas nga pagtugot sa temperatura, ug angay alang sa taas nga temperatura nga reverse transcription.Busa, kini makatabang sa pagwagtang sa dili maayo nga mga epekto sa RNA nga taas nga lebel nga istruktura ug dili piho nga mga hinungdan sa cDNA synthesis, ug adunay mas taas nga kalig-on ug reverse transcription synthesis nga abilidad.Ang enzyme adunay mas taas nga kalig-on ug reverse transcription synthesis nga abilidad.
Mga sangkap
1.200 U/μL nga Neoscript Reverse Transcriptase
2.5 × First-Strand Buffer (opsyonal)
* 5 × First-Strand Buffer walay dNTP, palihog idugang ang mga dNTP sa pag-andam sa reaction system
Girekomenda nga Aplikasyon
1.Usa ka lakang nga qRT-PCR.
2.RNA virus detection.
Kondisyon sa Pagtipig
-20°C alang sa taas nga termino nga pagtipig, kinahanglan nga sagol nga maayo sa dili pa gamiton, likayan ang kanunay nga pag-freeze-thaw.
Kahubitan sa Yunit
Ang usa ka yunit adunay 1 nmol sa dTTP sulod sa 10 ka minuto sa 37°C gamit ang poly(A)•oligo(dT)25isip template/primer.
Pagkontrol sa Kalidad
1.SDS-PAGE electrophoretic purity labaw pa kay sa 98%.
2.Pagkasensitibo sa pagpadako, pagkontrol sa batch-to-batch, kalig-on.
3.Walay exogenous nuclease nga kalihokan, walay exogenous endonuclease o exonuclease kontaminasyon
Setup sa Reaksyon para sa First Chain Reaction Solution
1.Pag-andam sa sagol nga reaksyon
| Mga sangkap | Tomo |
| Oligo(dT)12-18 Primer o Random nga Primera O Gene Specific Primersb | 50 pm |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 pmol | |
| 10 mM dNTP | 1 μL |
| Template RNA | Kinatibuk-ang RNA≤ 5μg;mRNA≤ 1 ug |
| RNase-walay dH2O | Sa 10 μL |
Mubo nga sulat:a/b: Palihug pagpili ug lain-laing klase sa primers sumala sa imong pang-eksperimentong mga panginahanglan.
2.Init sa 65°C sulod sa 5mins ug paspas nga pabugnawon sa yelo sulod sa 2mins.
3.Idugang ang mosunod nga mga sangkap sa sistema sa ibabaw sa kinatibuk-ang gidaghanon nga 20µL ug hinayhinay nga isagol:
| Mga sangkap | Tomo (μL) |
| 5 × First-Strand Buffer | 4 |
| Neoscript Reverse Transcriptase (200 U/μL) | 1 |
| RNase inhibitor (40 U/μL) | 1 |
| RNase-walay dH2O | Sa 20 μL |
4. Palihog buhata ang reaksyon sumala sa mosunod nga mga kondisyon:
(1) Kon Random Primer gigamit, ang reaksyon kinahanglan nga gidala sa gawas sa 25 ℃ alang sa 10mins, ug unya sa 50 ℃ alang sa 30 ~ 60mins;
(2) Kung gigamit ang Oligo dT o piho nga mga primer, ang reaksyon kinahanglan himuon sa 50 ℃ sa 30 ~ 60mins.
5.Pag-init sa 95 ℃ sulod sa 5 ka minuto aron dili maaktibo ang Neoscript Reverse Transcriptase ug tapuson ang reaksyon.
6.Ang reverse transcription nga mga produkto mahimong gamiton direkta sa PCR reaction ug fluorescence quantitative PCR reaction, o tipigan sa -20 ℃ sulod sa taas nga panahon.
PCR Raksyon:
1.Pag-andam sa sagol nga reaksyon
| Mga sangkap | Konsentrasyon |
| 10 × PCR Buffer (walay dNTP, walay Mg²+) | 1 × |
| dNTPs (10mM matag dNTP) | 200 μM |
| 25 mM MgCl2 | 1-4 mM |
| Taq DNA Polymerase (5U/μL) | 2-2.5 U |
| Primer 1 (10 μM) | 0.2-1 μM |
| Primer 2 (10 μM) | 0.2-1 μM |
| Templatea | ≤10% Unang Chain Reaction Solution (2 μL) |
| ddH2O | Sa 50 μL |
Mubo nga sulat:a: Kung daghan kaayo ang una nga solusyon sa reaksyon sa kadena nga idugang, ang reaksyon sa PCR mahimong mapugngan.
2.Pamaagi sa Reaksyon sa PCR
| Lakang | Temperatura | Panahon | Mga siklo |
| Pre-denaturasyon | 95 ℃ | 2-5 ka min | 1 |
| Denaturasyon | 95 ℃ | 10-20 ka seg | 30-40 |
| Pag-ani | 50-60 ℃ | 10-30 ka seg | |
| Extension | 72 ℃ | 10-60 ka seg |
Mga nota
1.Angayan alang sa reverse transcription temperatura optimization sa han-ay sa 42 ℃ ~ 55 ℃.
2.Kini adunay mas maayo nga kalig-on, mao ang angay alang sa taas nga temperatura reverse transcription amplification.Dugang pa, kini mao ang paborable alang sa episyente nga pag-agi sa mga komplikado nga istruktura nga mga rehiyon sa RNA.Usab, kiniangay alang sa usa ka lakang nga multiplex fluorescence quantitative RT-PCR detection.
3.Maayo nga pagkaangay sa lainlaing mga enzyme sa pagpadako sa PCR ug angay alang sa taas nga pagkasensitibo sa mga reaksyon sa RT-PCR.
4.Angayan alang sa taas nga pagkasensitibo sa usa ka lakang nga fluorescence quantitative RT-PCR nga reaksyon, epektibo nga mapaayo ang rate sa pagkakita sa mubu nga konsentrasyon sa mga template.
5.Angayan alang sa pagtukod sa librarya sa cDNA.
