EndoFree Plasmid Maxi Kit
Ang kini nga kit angayan alang sa pagkuha gikan sa 150 - 300 ml nga solusyon sa bakterya nga gikulata sa tibuok gabii, gamit ang gipaayo nga pamaagi sa SDS-alkaline lysis aron lyse ang bakterya.Ang krudo nga kinuha gipili nga gihiusa sa usa ka talagsaon nga Endotoxin Scavenger ug gibulag sa centrifugation aron makuha ang mga endotoxin.Dayon, ang silica gel membrane pili nga nagbugkos sa plasmid DNA sa solusyon ubos sa mga kondisyon sa taas nga asin ug ubos nga pH.Gisundan kini sa pagdugang sa wash buffer aron makuha ang mga hugaw ug uban pang mga sangkap sa bakterya.Sa kataposan, ang usa ka low-salt, high-pH elution buffer gigamit sa pag-elute sa puro nga plasmid DNA gikan sa silicon matrix membrane.Ang silica gel lamad naggamit espesyal nga adsorption lamad, ug ang adsorption kantidad kalainan tali sa kolum ug sa kolum gamay kaayo ug ang repeatability maayo.Ang phenol, chloroform ug uban pang makahilo nga reagents wala kinahanglana, ug ni ang ethanol precipitation nga mga lakang.Kini nga kit mahimong magamit sa paspas nga pagkuha sa 0.2 -1.5 mg sa puro nga high-copy nga plasmid DNA, nga adunay rate sa pagkuha nga 80% -90%.Ang kit naggamit sa usa ka talagsaon nga pormula sa proseso nga nagtangtang sa endotoxin, ang sulod sa endotoxin hilabihan ka ubos ug ang epekto sa pagbalhin sa selula maayo kaayo.Ang gikuha nga plasmid mahimong direktang gamiton sa enzyme digestion, PCR, in vitro transcription, transformation, sequencing ug uban pang molecular biology experiments.
Mga kahimtang sa pagtipig
Ang RNaseA kinahanglan nga tipigan sa -30 ~ -15 ℃ ug ibalhin sa ≤0 ℃.
Ang Endotoxin Scavenger mahimong tipigan sa 2 ~ 8 ℃ sulod sa usa ka bulan, gitipigan sa -30 ~ -15 ℃ alang sa dugay nga pagtipigug gidala sa ≤0 ℃ .
Ang ubang mga sangkap kinahanglan nga tipigan sa temperatura sa lawak (15 ~ 25 ℃) ug ibalhin sa temperatura sa lawak.
Mga sangkap
| Mga sangkap | 10RXNS |
| RNase A | 750 μL |
| Buffer P1 | 75 ml |
| Buffer P2 | 75 ml |
| Buffer P4 | 75 ml |
| Endotoxin Scavenger | 25 ml |
| Buffer PW | 2 × 22 ml |
| Buffer TB | 20 ml |
| FastPure DNA Maxi Columns ( Matag usa sa 50ml Collection Tube) | 10 |
| Endotoxin-free Collection Tube | 2 × 5 |
RNaseA:10 mg/ml, gigamit sa pagtangtang sa RNA.
Buffer P1:bacterial suspension buffer, idugang ang RNaseA sa Buffer P1 sa dili pa gamiton.
Buffer P2:bacterial lysis buffer (nga adunay SDS/NaOH).
Buffer P4:pag-neutralize sa buffer.
Endotoxin Scavenger:epektibo nga makuha ang endotoxin gikan sa krudo nga plasmid extract.
Buffer PW:paghugas buffer, idugang ang gitakda nga gidaghanon sa ethanol sa dili pa gamiton.
Buffer TB:elution buffer.
FastPure DNA Maxi Column:Mga kolum sa adsorption sa plasmid DNA.
Mga Tubong Koleksyon 50 ml:filtrate nga mga tubo sa pagkolekta.
Endotoxin-free Collection Tube:plasmid DNA collection tubes.
Giandam nga mga Materyal
Absolute nga ethanol, isopropanol, 50 ml round-bottom centrifuge tubes ug 50 ml endotoxin-freemga tubo sa centrifuge.
Mga aplikasyon
Kini nga produkto angay alang sa dinagkong pagkuha sa mga plasmid gikan sa 150 - 300 ml nga solusyon sa bakteryakultura sa tibuok gabii.
Proseso sa Eksperimento
1. Pagkuha ug 150 – 200 ml (dili mosobra sa 300 ml) sa bacterial solution nga gikulata sa tibuok gabii ug centrifuge samga 11,000 rpm (12,000 × g) sa 1 – 2 min.Isalikway ang supernatant ug kolektaha ang bakterya.
Δ Sa diha nga ang pagkolekta labaw pa kay sa 50 ml sa bakterya nga solusyon, ang bakterya mahimong kolektahon pinaagi sa pagdugang sa bakterya nga solusyon, centrifugation, paglabay sa supernatant ug uban pang mga lakang sa sama nga 50 ml tube alang sa
daghang beses.
2. Idugang ang 7.5 ml nga Buffer P1 (palihug susiha kon ang RNaseA gidugang sa Buffer P1) sa centrifugetube nga adunay sulod nga bakterya ug sagol nga maayo pinaagi sa vortex o pipetting.
Δ Ang kompleto nga resuspension sa bakterya sa kini nga lakang hinungdanon aron mamunga, ug kinahanglan nga wala’y mga kumpol sa bakterya pagkahuman sa pagsuspinde.Kung adunay mga bacterial clumps nga dili hingpit nga sagol, kini makaapekto sa lysis, nga moresulta sa ubos nga ani ug kaputli.Kung ang OD600 sa bacterial solution kay 0.65, girekomendar nga 7.5 ml sa Buffer P1 ang gamiton sa pagkuha gikan sa 150 ml nga bacterial solution;kung ang OD600 kay 0.75, 8 ml sa Buffer P1 ang kinahanglan gamiton ug ang mga volume sa Buffers P2 ug P4 kinahanglang usbon sumala niana.Kung ang gidaghanon sa bakterya nga solusyon madugangan sa 200 ml, girekomenda nga angAng gidaghanon sa Buffers P1, P2, ug P4 madugangan nga proporsyonal.
3. Idugang ang 7.5 ml nga Buffer P2 sa bacterial suspension gikan sa step 2 ug hinayhinay nga isagol pataas ug paubos sa 6 – 8mga panahon ug paglumlum sa temperatura sa lawak sulod sa 4-5 ka minuto.
Δ Balit-a ang hinay aron maayo ang pagsagol.Ang vortexing maoy hinungdan sa genomic DNA fragmentation, nga moresulta sa genomic DNA fragments sa gikuha nga plasmid.Niini nga panahon, ang solusyon mahimong viscous ug translucent, nga nagpakita nga ang bakterya hingpit nga na-lysed.Ang gidugayon kinahanglan dili molapas sa 5 min aron malikayan ang pagkaguba sa mga plasmid.Kung dili klaro ang solusyon, mahimo’g adunay daghang bakterya nga moresultadili kompleto nga lysis, mao nga ang gidaghanon sa mga bakterya kinahanglan nga pagkunhod sa tukma.
4. Idugang ang 7.5 ml nga Buffer P4 sa bacterial suspension gikan sa step 3 ug hinayhinay nga balit-aron 6 – 8 ka beses aron ang solusyon hingpit nga ma-neutralize ang Buffer P2.Niini nga panahon, kinahanglan nga makita ang puti nga flocculent precipitate.Centrifuge sa kapin sa 11,000 rpm (12,000 × g) sulod sa 10 – 15 min, pag-ayo nga i-pippette ang supernatant ngadto sa bag-ong 50 ml nga round-bottom centrifuge tube (self-prepared), ug likayiaspirate ang naglutaw nga puti nga precipitate.
Δ Idugang ang Buffer P4 ug ibalik dayon aron maayo ang pagsagol.Pasagdi ang tubo nga mobarog hangtod nga ang puti nga precipitate maapod-apod nga parehas sa tibuuk nga solusyon aron mapugngan ang paghimo sa lokal nga ulan nga makaapekto sa neutralisasyon.Kung walay uniporme nga puti nga flocculent precipitate sa wala pa ang centrifugation ug ang supernatant dili klaro human sa centrifugation, ang tubo mahimongcentrifuged alang sa laing 5 min.
5. Idugang ang 0. 1 ka beses ang volume (10% sa supernatant volume, mga 2.2 ml) sa Endotoxin Scavenger ngadto sa supernatant gikan sa step 4 ug balit-aron sa pagsagol.Ibutang ang solusyon sa usa ka ice bath o isulod sa nahugno nga yelo (o refrigerator freezer) sulod sa 5 min hangtod ang solusyon mausab gikan sa lapok ngadto sa tin-aw ug transparent (o sa gihapon.medyo lapok), ug usahay magsagol sa makadaghang higayon.
Δ Human ang Endotoxin Scavenger idugang sa supernatant, ang supernatant mahimong lapok apan angAng supernatant kinahanglan nga mahimong tin-aw (o gamay nga lapok) human sa pagpabugnaw sa ice bath.
6. Human mabutang ang supernatant sa temperatura sa kwarto (>25 ℃) sulod sa 10 - 15 ka minuto, kini mahimong lapok sama saang temperatura niini mosaka sa temperatura sa lawak.Unya ang superna-tant kinahanglan nga balit-ad aron masagol.
Δ Kung ang temperatura sa kwarto mas ubos o gusto nimo nga makunhuran ang oras sa pagkuha, ang supernatant mahimong i-incubated sa usa ka 37 ~ 42 ℃ nga kaligoanan sa tubig sulod sa 5 - 10 min ug ang sunod nga lakang mahimo’g pagkahuman sa supernatant.nahimong turbid.
7. I-centrifuge ang supernatant sa mga 11,000 rpm (12,000 × g) sulod sa 10 min sa temperatura sa lawak (temperatura kinahanglang> 25 ℃) aron mabulag ang bahin.Ang ibabaw nga bahin sa tubig adunay DNA samtang ang ubos nga asul nga oily phase layer adunay endotoxin ug uban pang mga hugaw.Pagbalhin saDNA-nga adunay aqueous phase ngadto sa usa ka bag-o nga tubo ugisalikway ang oily layer.
Δ Ang temperatura sa panahon sa centrifugation kinahanglan nga labaw sa 25 ℃ tungod kay ang epektibo nga pagbulag sa bahin dilimahitabo kung ang temperatura ubos kaayo.
Δ Kung ang pagbulag sa hugna dili epektibo, ang temperatura sa centrifugation mahimong ipasibo sa 30 ℃ ugang oras sa centrifugation mahimong madugangan ngadto sa 15 min.
Δ Ayaw pagsupsop sa asul nga oily layer tungod kay kini adunay endotoxin ug uban pang mga hugaw.
Mekanismo
Pag-neutralize sa Resuspension Lysis
◇ Idugang ang 7.5 ml nga Buffer P1
◇ Idugang ang 7.5 ml nga Buffer P2
◇ Idugang ang 7.5 ml nga Buffer P4
Pagtangtang sa endotoxin
◇Idugang ang 0. 1 ka beses ang supernatant volume sa Endotoxin Scavenger
Pagbugkos ug Paghugas
◇ Idugang ang 0.5 ka beses sa gidaghanon sa isopropanol
◇ Pagdugang og 10 ml nga Buffer PW
◇ Pagdugang og 10 ml nga Buffer PW
Elution
◇ Pagdugang og 1 – 2 ml nga Buffer TB o walay Endotoxin nga ddH2O
