M-MLV Reverse Transcriptase
Ang RevScript Reverse transcriptase nakuha pinaagi sa teknolohiya sa genetic engineering.Kini adunay mas taas nga cDNA synthesis nga abilidad, thermal stability ug reaction temperature limit (hangtod sa 60°C).Ang synthesized nga produkto sa cDNA hangtod sa 10 kb.Gipauswag niini ang pagkadugtong sa mga templates ug angayan alang sa reverse transcription sa mga template sa RNA nga adunay komplikado nga sekondaryang istruktura o ubos nga kopya nga mga gene.
Mga sangkap
| Component | HC2003B (10,000U) | HC2003B (5*10,000U) | HC2003B (200,000U) |
| RevScript Reverse Transcriptase (200U/μL) | 50 μL | 5 × 50 μL | 1 mL |
| 5 × RevScript Buffer | 250 μL | 1.25 mL | 5 mL |
Kondisyon sa Pagtipig
Kini nga produkto kinahanglan nga tipigan sa -25°C~-15°C sulod sa 2 ka tuig.
Kahubitan sa Yunit
Ang usa ka yunit naglakip sa 1 nmol sa dTTP ngadto sa acid-insoluble nga materyal sa 10 minutos sa 37°C gamit ang Oligo(dT) isip primers.
Setup sa Reaksyon
1.Denaturasyon sa RNA template (Kini nga lakang mao ang opsyonal, denaturation sa RNA template makatabang sa pag-abli sa ikaduha nga mga istruktura, nga makapauswag sa abot sa unang strand cDNA.)
| Mga sangkap | Tomo (μL) |
| RNase nga libre nga ddH2O | Sa 13 |
| Oligo(dT)18 (50 μmol/L) o Random nga Primer (50 μmol/L) O Gene Specific Primer (2 μmol/L) | 1 |
| o 1 | |
| o 1 | |
| RNA template | X a |
Mubo nga sulat:
1) a: Kinatibuk-ang RNA: 1-5 ug o mRNA: 1-500 ng
2) Paglumlom sa 65°C sulod sa 5 minutos, dayon ibalhin sa yelo dayon aron pabugnawon sulod sa 2 ka minutos.Mubo nga centrifugation aron makolekta ang reaction liquid, idugang ang reverse transcription reaction solution sama sa gipakita sa mosunod nga lamesa.Hinayhinay nga pag-pipette aron isagol.
1.Pag-andam sa sagol nga reaksyon (20 μL nga gidaghanon)
| Mga sangkap | Tomo (μL) |
| Pagsagol sa miaging lakang | 13 |
| 5 × Buffer | 4 |
| Pagsagol sa dNTP (10nmol/L) | 1 |
| Reverse Transcriptase (200 U/μL) | 1 |
| RNase inhibitor (40 U/μL) | 1 |
1.Buhata ang reaksyon ubos sa mosunod nga mga kondisyon:
| Temperatura (°C) | Panahon |
| 25 °Ca | 5mins |
| 42 °Cb | 15-30mins |
| 85 °Cc | 5mins |
Mubo nga sulat:
1) a.Ang paglumlum sa 25°C sulod sa 5mins gikinahanglan lamang sa paggamit sa random hexamers.Palihug laktawan kini nga lakang kung mogamit Oligo (dT)18o Gene Specific Primer.
2) b.Ang girekomendar nga reverse transcription nga temperatura mao ang 42°C, Para sa mga templates nga adunay komplikadong secondary structures o taas nga GC content, girekomendar nga ipataas ang reaction temperature ngadto sa 50-55°C.
3) c.Pagpainit sa 85 ° C sulod sa 5mins aron ma-inactivate ang reverse transcriptase.
4) Ang produkto mahimong direktang gamiton sa PCR o qPCR reactions, o tipigan sa -20°C para sa hamubo nga pagtipig.Girekomenda nga i-aliguot ang mga produkto ug tipigan sa -80°C para sa dugay nga pagtipig.Likayi ang kanunay nga freeze-thaw.
5) Ang produkto angay alang sa usa ka lakang nga RT-qPCR, girekomenda nga idugang ang 10-20 U reverse transcriptase alang sa matag 25μL nga sistema sa reaksyon, o anam-anam nga madugangan ang kantidad sa reverse transcriptase sumala sa aktwal nga sitwasyon.
Mga nota
1.Palihug hupti nga limpyo ang eksperimento nga lugar;Ang limpyo nga gwantes ug maskara kinahanglan isul-ob sa panahon sa operasyon.Ang tanan nga mga gamit nga gigamit sa eksperimento kinahanglan nga libre sa RNase aron malikayan ang kontaminasyon sa RNase.
2.Ang tanan nga mga pamaagi kinahanglan nga himuon sa yelo aron malikayan ang pagkadaot sa RNA.
3.Girekomenda ang taas nga kalidad nga mga sample sa RNA aron masiguro ang taas nga kahusayan sa reverse transcription.
4.Kini nga produkto alang lamang sa paggamit sa panukiduki.
5.Palihug pag-opera gamit ang mga lab coat ug disposable gloves, para sa imong kaluwasan.
