Mini Kit sa Pagkuha sa DNA

Mga kahimtang sa pagtipig

Tipigi sa -15 ~ -25 ℃ ug transport sa lawak temperatura.

Mga sangkap

Buffer GDP:DNA binding buffer.

Buffer GW:Paghugas buffer;idugang ang hingpit nga ethanol sa gipakita nga gidaghanon sa botelya sa dili pa gamiton.

Elution Buffer:Elution.

FastPure DNA Mini Columns-G:Mga kolum sa adsorption sa DNA.

Mga Tubong Koleksyon 2 ml:Mga tubo sa pagkolekta alang sa filtrate.

Giandam nga mga Materyal

1.5 ml nga sterilized nga mga tubo, hingpit nga ethanol ug isopropanol (sa dihang ang tipik sa DNA ≤100 bp, idugang ang 1 ka volume

isopropanol sa 1 volume gel), kaligoanan sa tubig.

Proseso sa Eksperimento

Idugang ang 80 ml nga ethanol aron matunaw ang Buffer GW ingon nga gipakita sa tag sa wala pa gamiton, tipigi sa temperatura sa kwarto.

Mekanismo

1. PCR reaksyon nga solusyon

Gel extraction scheme: Idugang ang patas nga volume Buffer GDP PCR reaction solution recovery scheme:Idugang ang 5 ka beses ang volume Buffer

2. GDP Kalkulahin ang gidaghanon sa gel(100  μl katumbas sa 100 mg)

Dissolve gel

3. Preheat sa 50 ~ 55℃

4. Paghugas sa Bind

Idugang ang 300 μL sa Buffer GDP*

Idugang ang 700 μL nga Buffer GW

Idugang ang 700 μL nga Buffer GW

5. Elute

Idugang ang 20 - 30μL nga Elution Buffer o deionized nga tubig

Mga nota* PCR reaction fluid recovery nga wala niini nga lakang

Programa sa pagkuha sa gel

1. Human sa DNA electrophoresis alang sa fractionating DNA fragments, excise ang usa ka stripe sa DNA fragment gikan sa agarose gel ubos sa UV nga kahayag.Girekomenda nga gamiton ang absorbent nga papel aron masuhop ang dayag nga kaumog sa gel ug mamenosan ang gidak-on sa hiwa sa gel pinaagi sa pagtangtang sa dugang nga agarose kutob sa imong mahimo.Timbanga ang hiwa sa gel (walay microcentrifuge tube) aron makalkulo ang gidaghanon niini: Ang gidaghanon sa 100 mg nga gelslice maoy gibana-bana nga 100 μL, nga nagtuo nga ang densidad maoy 1g/ml.

2. Idugang ang patas nga gidaghanon Buffer GDP, incubate sa 50 ~ 55 ℃ alang sa 7-10 min (sumala sa gidak-on sa gel, i-adjust ang oras sa paglumlum hangtud nga ang gel hingpit nga matunaw).Balika ang tubo 2 ka beses sa panahon sa paglumlum.

Δ Ang pagdugang sa 1-3 ka volume sa Buffer GDP dili makaimpluwensya sa pagkaayo sa DNA recovery.Kung ang DNA fragment nga mabawi <100 bp, 3 ka volume sa Buffer GDP ang kinahanglan idugang;kung ang hiwa sa gel hingpit nga matunaw, idugang ang 1 nga gidaghanon sa isopropanol ug isagol nga maayo, dayon ipadayon ang sunod nga lakang.

3. Centrifuge sa makadiyot aron madala ang sample ngadto sa ubos sa tubo, isulod ang FastPure DNA Mini Columns-G ngadto sa Collection Tubes 2 ml, maampingong ibalhin ang solusyon sa maximum nga 700 μL kausa sa usa ka

oras sa mga kolum sa pagsala, centrifuge sa 12,000 rpm (13,800 X g) sa 30-60 sec.

4. Isalikway ang filtrate ug idugang ang 300 μL sa Buffer GDP sa kolum, paglumlom sa temperatura sa lawak sulod sa 1 min, centrifuge sa 12,000 rpm (13,800 X g) sulod sa 30-60 ka segundo.

5. Isalikway ang filtrate ug idugang ang 700 μL nga Buffer GW (susiha kon ang absolute nga ethanol gidugang daan!) ngadto sa kolum, centrifuge sa 12,000 rpm (13,800 X g) sulod sa 30-60 sec.

Δ Palihog idugang ang Buffer GW sa palibot sa adsorption column wall, o idugang ang Buffer GW nga hapin sa likod ug isagol kini nga baliskad sulod sa 2 - 3 ka beses aron hingpit nga ma-flush ang asin nga mipilit sa bungbong sa tubo.

6. Balika ang lakang 5.

Δ Pag-flush sa Buffer GW kaduha makasiguro nga ang asin hingpit nga matangtang ug mawagtang ang epekto sa sunod nga mga eksperimento.

7. Isalikway ang filtrate ug centrifuge ang walay sulod nga kolum sa 12,000 rpm (13,800 X g) sulod sa 2 min.

8. Isulod ang kolum ngadto sa limpyo nga 1.5 ml nga microcentrifuge nga tubo, idugang ang 20 - 30 μL nga Elution Buffer ngadto sa sentro sa column membrane, i-incubate sulod sa 2 min, ug dayon centrifuge sa 12,000 rpm (13,800 X g) alang sa1 min.Isalikway ang kolum, tipigi ang nakuha nga DNA sa -20 .

Δ Pagbalhin sa supernatant sa lakang 8 ngadto sa kolum aron ma-elute pag-usab ug preheat ang Elution Buffer ngadto sa 55 (kon ang DNA fragment>3 kb) tingali makatabang aron madugangan ang pagkaayo sa pagkaayo.

Programa sa pagbawi sa mga produkto sa PCR

Kini nga protocol magamit sa pagputli sa mga tipik sa DNA gikan sa mga produkto sa PCR, sistema sa reaksyon sa enzymatic ug uban pang mga produkto sa krudo sa DNA (lakip ang genetic DNA).Kini nga solusyon epektibo nga makatangtang sa lainlaing mga nucleotide, primer, primer dimer, molekula sa asin, enzyme ug uban pang mga hugaw.

1. Mubo nga centrifuge ang mga produkto sa PCR, enzymatic reaction solution, ug ubang mga produkto sa krudo sa DNA.Gibanabana ang ilang gidaghanon gamit ang pipette ug ibalhin sa usa ka sterilized nga 1.5 ml o 2 ml nga tubo.Idugang ang ddH2O hangtod sa gidaghanon hangtod sa 100 μL;samtang alang sa genomic DNA nga adunay taas nga konsentrasyon, ang pagtunaw sa 300 μL nga adunay ddH2O makatabang sa pagpauswag sa pagkaayo sa pagkaayo.

2. Idugang ang 5 ka volume sa Buffer GDP, isagol pag-ayo pinaagi sa pagbalit-ad o pag-vortex.Kung ang DNA fragment sa interes> 100 bp, dugang nga 1.5 ka volume (mga sample + Buffer GDP) sa ethanol kinahanglan idugang.

3. Isulod ang column balik sa collection tube, ibalhin ang mixtrue ngadto sa column, centrifuge sa 12,000 rpm (13,800 ×g) sulod sa 30 - 60 sec.Kung ang gidaghanon sa gisagol nga solusyon kay> 700 µL, ibutang ang adsorption column balik sa collection tube, ibalhin ang nahabilin nga solusyon sa adsorption column, ug centrifuge sa 12,000 rpm (13,800 × g) sulod sa 30 - 60 sec.

4. Ang sunod nga pasundayag nagtumong sa lakang 5 – 8 sa 08- 1/Gel extraction program.