Tanum direkta nga PCR Kit

Iring No: HCR2020A

Ang Plant Direct PCR Kit angayan alang sa direktang pagpadako sa mga dahon sa tanom, mga liso, ug uban pa, ug mahimong gamiton alang sa high-throughput screening sa mga sample sa tanom nga walay polysaccharides ug polyphenols.Ang direkta nga amplification nga DNA polymerase base sa gitumong nga ebolusyon adunay labaw nga pagtugot sa PCR inhibitors sa mga tanum.Samtang, kini nagmintinar sa taas nga amplification performance, nga mao ang angay alang sa amplification sa DNA tipik sulod sa 5 kb.Ang talagsaon nga Lysis buffer A sa kit mahimong magamit sa pag-lyse sa presko o frozen nga mga tisyu sa tanum.Sayon ang pag-operate ug ang lysate mahimong magamit ingon usa ka template alang sa pagpadako nga wala’y pagputli.Ang sistema adunay mga ahente sa pagpanalipod nga makahimo sa mga sampol sa krudo nga epektibo nga mapadako pagkahuman sa balik-balik nga pagyelo ug pagtunaw.Ang 2 × Plant Direct Master Mix kinahanglan lamang nga magdugang sa mga primer ug templates aron mahimo ang amplification reaction, sa ingon makunhuran ang mga operasyon sa pipetting ug mapausbaw ang detection throughput ug reproducibility sa mga resulta.

Mga sangkap

*Ang Plant Direct Lysis Buffer B usa ka opsyonal nga reagent, nga gigamit sa pag-neutralize sa Plant Direct Lysis Buffer A para sa pagpalugway sa oras sa pagtipig sa mga sample.Mahimo kining gamiton sumala sa aktuwal nga sitwasyon.

Mga Kondisyon sa Pagtipig

2 × Plant Direct Master Mix, tipigi sa -30 ~ -15 ℃ ug likayan ang balikbalik nga pagyelo ug pagtunaw;Plant Direct Lysis Buffer, tipigi sa -30 ~ -15 ℃ o 2 ~ 8 ℃.

Proseso sa Eksperimento

Pagproseso sa Sampol–Dahon sa Tanum

Direkta nga pamaagi:Girekomenda nga gamiton ang mga batan-ong dahon.Gamit ug hole punch nga adunay fixed diameter nga 0.5 – 3 mm para makakuha ug gamay ug uniporme nga samplea, ug dayon idugang ang sample sa PCR system (50 μl system ang girekomenda).Timan-i, siguroha nga ang sample anaa sa PCR solution ug dili batok sa tube wall.Kung ang direkta nga PCR gigamit sa pagpadako sa tag-as nga mga tipik ug komplikado nga mga sample, ang paggamit sa usa ka sample nga adunay gamay nga diyametro (0.5 - 1 mm) ingon usa ka template makatabang sa pagkuha sa mas maayo nga mga sangputanan.

Pamaagi sa paggaling sa lysis:Girekomenda nga gamiton ang mga batan-ong dahon.Pagkuha ug gamay nga piraso sa dahon (mga 1 – 3 mm ang diyametro), ibutang kini sa 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab, ug galinga kini kutob sa mahimo (kini nga lakang mahimo pinaagi sa pagpislit sa dahon gamit ang 100 μl pipette tip. aron mash ang sample).Kung gigamit ang daghang mga volume sa tisyu sa dahon (dili molapas sa 7 mm), dugangi ang gidaghanon sa dilution buffer sa 50 μl.Pagkahuman sa mga dahon sa yuta, ang solusyon kinahanglan nga makita nga berde.Human sa mubo nga centrifugation, idugang ang 1 μl sa supernatant sa PCR system isip template sa reaksyon.

Pamaagi sa Thermal lysis:Girekomenda nga gamiton ang mga batan-ong dahon.Pagkuha ug gamay nga piraso sa dahon (mga 1 – 3 mm ang diyametro), ibutang kini sa 20 μl Plant Direct Lysis Buffer A, ug ipainit kini sa 95°C sulod sa 5 – 10 min.Ang oras sa lysis mahimong tukma nga mapalawig alang sa mga dahon nga lisud lisehon (dili molapas sa 20 min).Kung gigamit ang daghang mga volume sa tisyu sa dahon (dili molapas sa 7 mm), dugangi ang gidaghanon sa dilution buffer sa 50 μl.Human sa pagpainit, centrifuge sa makadiyot, ug idugang ang 1 μl nga supernatant sa PCR system isip template sa reaksyonb.

Pagproseso sa Sampol– Binhi sa Tanum

Pamaagi sa paggaling sa lysis:Gamit ug scalpel ang mga liso nga may diyametro nga 5 mm, idugang kini sa 100 μl nga Plant Direct Lysis Buffer A, ug galinga ang sample gamit ang pipette tip o uban pang mga himan.Pag-vortex sa makadiyot ug pabarug sa temperatura sa kwarto sulod sa 3 - 5 ka minuto.Siguroa nga ang sampol sa liso naunlod sa dilution buffer.Human sa mubo nga centrifugation, idugang ang 1 μl sa supernatant sa PCR system isip template sa reaksyon.

Pamaagi sa Thermal lysis:Gamit ug scalpel ang pagputol sa mga liso nga may diyametro nga 5 mm, idugang kini sa 100 μl sa Plant Direct Lysis Buffer A, ug init sa 95°C sulod sa 5 – 10 min.Ang oras sa lysis mahimong tukma nga mapalawig alang sa mga dahon nga lisud lise (dili molapas sa 30 min).Human sa pagpainit, centrifuge sa makadiyot, ug idugang ang 1 μl supernatant sa PCR system isip template sa reaksyonb.

a.Ang mga gunting o uban pang mga himan mahimo usab nga gamiton sa pagputol sa mga sampol sa angay nga gidak-on;kung ang suntok o gunting gigamit pag-usab, kini kinahanglan nga limpyohan sa 2% nga sodium hypochlorite nga solusyon sa dili pa gamiton aron malikayan ang kontaminasyon sa krus tali sa mga sample.

b.Siguroha nga ang Plant Direct Lysis Buffer hingpit nga natunaw sa dili pa gamiton.Kung ang buffer viscous o adunay precipitates, mahimo kini nga init sa 37 ℃ aron hingpit nga matunaw kini sa dili pa gamiton.

c.Ang gidaghanon sa template sa reaksyon nga sistema mahimong ipasibo sa tukma sumala sa kalainan sa gidaghanon sa tanom nga materyal ug diluent idugang.

Tanum Direktang Lysis Buffer

Ang Plant Direct Lysis Buffer A nga naa niini nga produkto hugot nga gi-optimize aron buhian ang genome sa kadaghanan nga mga tisyu sa tanum ug angayan alang sa mubo nga pagtipig sa mga tanum nga krudo sa 4 ℃.Kung ang sample kinahanglan nga tipigan sa mas taas nga panahon (pananglitan, 1 - 2 ka bulan), girekomenda nga ibalhin ang supernatant sa usa ka bag-ong EP tube ug ibutang kini sa -20 ℃.Aron matipigan ang mga sample nga mas lig-on, idugang ang parehas nga gidaghanon sa Plant Direct Lysis Buffer B sa gibalhin nga supernatant, sagol nga maayo ug ibutang sa -20 ℃.Ang stable nga oras sa pagtipig magkalainlain sa mga sample sa tanum ug estado.

Sistema sa Reaksyon

a.Kini adunay Mg²⁺sa katapusan nga konsentrasyon sa 2 mM.

b.Girekomenda nga gamiton ang katapusang konsentrasyon nga 0.4μM alang sa matag primer.Ang sobra nga paggamit sa mga primer magdala ngadto sa dugang nga dili piho nga pagpadako.

c.Ang gidaghanon sa sample nga gigamit mahimong ipasibo sumala sa aktuwal nga sitwasyon.Ang kantidad nga gigamit sa usa ka reaksyon sa crude lysed sample mahimong i-adjust tali sa 2% - 20% sa kinatibuk-ang gidaghanon sa reaksyon.Ang paggamit sa sobra nga mga sample mahimong hinungdan sa pagkapakyas sa pagpadako.

Programa sa Reaksyon

a.Inisyal nga Denaturasyon (98 ℃, 5 min) nagpasiugda sa lysis sa tisyu sa tanum, nagpagawas sa genomic DNA nga magamit alang sa PCR amplification.Ayaw pagpamubo sa oras o pagpaubos sa temperatura.

b.Girekomenda nga ibutang kini nga katumbas sa primer Tm nga kantidad o 2 ~ 4 ℃ nga mas taas kaysa sa Tm nga kantidad.Ang direkta nga amplification DNA polymerase nga gigamit sa kini nga produkto lahi sa naandan nga Taq DNA polymerase, ug adunay espesyal nga mga kinahanglanon alang sa temperatura sa reaksyon sa annealing; ang paggamit sa taas nga temperatura sa annealing epektibo nga makunhuran ang dili piho nga pagpadako ug mapaayo ang kahusayan sa pagpadako.Alang sa komplikado nga mga template, ang episyente nga pagpadako mahimong makab-ot pinaagi sa pag-adjust sa temperatura sa annealing ug pagpalugway sa oras sa pagpalawig.

c.Kung ang gitas-on sa produkto sa amplification kay ≤1 kb, ang oras sa pagpalawig gitakda sa 30 sec/kb;kung ang gitas-on sa produkto sa amplification mao ang> 1 kb, ang oras sa extension gitakda sa 60 sec/kb.

d.Alang sa komplikadong mga sampol o mga sampol nga adunay ubos nga abot sa amplification, ang gidaghanon sa mga siklo mahimong tukma nga madugangan ngadto sa 40 -50 nga mga siklo.

Mga aplikasyon

Magamit kini alang sa direkta nga pagpadako sa mga tisyu sa tanum ug high-throughput screening sa mga sample sa tanum nga wala’y polysaccharides ug polyphenols.

Mga nota

Alang sa paggamit sa panukiduki lamang.Dili alang sa paggamit sa diagnostic nga mga pamaagi.

1. Para sa crude plant amplification o direct amplification, girekomendar nga gamiton ang purified genomic DNA isip positibong kontrol sa dili pa magsugod ang eksperimento aron masiguro nga ang sistema, primers ug mga operasyon husto.

2. Ang direkta nga amplification nga DNA polymerase nga gigamit niini nga kit adunay kusog nga kalihokan sa pag-proofread.Kung gikinahanglan ang pag-clone sa TA, girekomenda nga limpyohan ang DNA sa dili pa idugang ang adenine.

3. Giya sa Panguna nga Disenyo:

a.Girekomenda nga ang katapusan nga base sa 3′ nga katapusan sa primer kinahanglan G o C.

b.Kinahanglang likayan ang sunodsunod nga mismatch sa kataposang 8 ka base sa 3′ nga kataposan sa primer.c.Likayi ang mga istruktura sa hairpin sa 3′ nga tumoy sa primer.

d.Ang mga kalainan sa Tm value sa forward primer ug sa reverse primer kinahanglang dili molapas sa 1 ℃ ug ang Tm value kinahanglang i-adjust ngadto sa 60 ~ 72 ℃ (Primer Premier 5 girekomendar nga kuwentahon ang Tm value).

e.Ang dugang nga dugang nga mga han-ay sa primero nga dili motakdo sa template, dili angay iapil sa pagkuwenta sa primerong Tm nga bili.

f.Girekomenda nga ang sulud sa GC sa primer nga 40% -60%.

g.Ang kinatibuk-ang pag-apud-apod sa A, G, C ug T sa primer kinahanglan nga ingon sa mahimo.Likayi ang paggamit sa mga rehiyon nga taas ang sulod sa GC o AT.

h.Likayi ang presensya sa mga komplementaryong han-ay sa 5 o labaw pa nga base sa sulod sa primer o tali sa duha ka primer ug likayan ang presensya sa komplementaryong han-ay sa 3 o labaw pa nga base sa 3′ nga tumoy sa duha ka primer.

i.Gamita ang function sa NCBI BLAST aron masusi ang espesipiko sa primer aron malikayan ang dili piho nga pagpadako.