Proteinase K mNGS (likido)
Ang Proteinase K usa ka lig-on nga serine protease nga adunay lapad nga espesipiko sa substrate.Gipaubos niini ang daghang mga protina sa lumad nga estado bisan kung adunay mga detergent.Ang ebidensya gikan sa kristal ug molekular nga mga pagtuon sa istruktura nagpakita nga ang enzyme iya sa subtilisin nga pamilya nga adunay aktibong site catalytic triad (Asp39-Iya69-Ser224).Ang nag-una nga dapit sa cleavage mao ang peptide bond kasikbit sa carboxyl group sa aliphatic ug aromatic amino acids nga adunay gibabagan nga alpha amino groups.Kini kasagarang gigamit alang sa lapad nga espesipiko niini.Kini nga proteinase K espesyal nga gidisenyo alang sa mNGS.Kung itandi sa uban nga proteinase K, kini adunay mas gamay nga nucleic acid nga kontaminasyon nga adunay parehas nga enzymatic performance, nga mas makasiguro sa downstream nga mNGS nga aplikasyon.
Mga Kondisyon sa Pagtipig
2-8 ℃ sulod sa 2 ka tuig
Espesipikasyon
| Panagway | Walay kolor ngadto sa light brown nga likido |
| Kalihokan | ≥800 U/ml |
| Konsentrasyon sa Protina | ≥20 mg/ml |
| Nickase | Walay namatikdan |
| DNAase | Walay namatikdan |
| RNase | Walay namatikdan |
Mga kabtangan
| Numero sa EC | 3.4.21.64(Recombinant gikan sa Tritirachium album) |
| Isoelektrik nga punto | 7.81 |
| Labing maayo nga pH | 7.0- 12.0 Hulagway 1 |
| Labing maayo nga temperatura | 65 ℃ Fig. 2 |
| kalig-on sa pH | pH 4.5- 12.5 (25 ℃, 16 h) Hulagway 3 |
| Thermal nga kalig-on | Ubos sa 50 ℃ (pH 8.0, 30 min) Fig. 4 |
| Kalig-on sa pagtipig | Kapin sa 90% nga kalihokan alang sa 12 ka bulan sa 25 ℃ |
| Mga activator | SDS, urea |
| Mga tigpugong | Diisopropyl fluorophosphate;phenylmethylsulfonyl fluoride |
Mga aplikasyon
1. Genetic diagnostic kit
2. RNA ug DNA extraction kits
3. Pagkuha sa mga sangkap nga dili protina gikan sa mga tisyu, pagkadaot sa mga hugaw sa protina, sama sa DNAmga bakuna ug pag-andam sa heparin
4. Pag-andam sa chromosome DNA pinaagi sa pulsed electrophoresis
5. Western blot
6. Enzymatic glycosylated albumin reagents sa vitro diagnosis
Panagana
Pagsul-ob ug protective gloves ug goggles kon mogamit o magtimbang, ug pabiling maayo ang bentilasyon human magamit.Kini nga produkto mahimong hinungdan sa reaksiyon sa alerdyi sa panit ug grabe nga pagkalagot sa mata.Kung mahawa, kini mahimong hinungdan sa alerdyi o mga sintomas sa hika o dyspnea.Mahimong hinungdan sa respiratory irritation.
Kahubitan sa yunit
Ang usa ka yunit (U) gihubit ingon ang gidaghanon sa enzyme nga gikinahanglan sa pag-hydrolyze sa casein aron makahimo og 1 μmoltyrosine kada minuto ubos sa mosunod nga mga kondisyon.
Pag-andam sa mga reagents
Reagent I: 1g milk casein natunaw sa 50ml sa 0.1M sodium phosphate solution (pH 8.0), gilumlum sa 65-70 ℃ nga tubig sulod sa 15mins, gikutaw ug natunaw, gipabugnaw sa tubig, gi-adjust sa sodium hydroxide ngadto sa pH 8.0, ug fixed volume 100ml.
Reagent II: 0.1M trichloroacetic acid, 0.2M sodium acetate, 0.3M acetic acid.
Reagent III: 0.4M Na2CO3solusyon.
Reagent IV: Forint reagent nga lasaw sa lunsay nga tubig sulod sa 5 ka beses.
Reagent V: Enzyme diluent: 0.1M sodium phosphate solution (pH 8.0).
Reagent VI: tyrosine solution: 0, 0.005, 0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.25 umol/ml tyrosine nga natunaw sa 0.2M HCl.
Pamaagi
1. Ang 0.5ml nga reagent I pre-warmed sa 37 ℃, idugang ang 0.5ml nga solusyon sa enzyme, isagol nga maayo, ug i-incubate sa37 ℃ sulod sa 10 ka minuto.
2. Idugang ang 1ml nga reagent II aron mahunong ang reaksyon, isagol nga maayo, ug ipadayon ang paglumlum sulod sa 30mins.
3. Centrifugate reaksyon solusyon.
4. Pagkuha ug 0.5ml nga supernatant, idugang ang 2.5ml nga reagent III, 0.5ml nga reagent IV, isagol ug maayo ug i-incubate sa 37 ℃sulod sa 30mins.
5. OD660gitino isip OD1;blangko nga kontrol nga grupo: 0.5ml reagent V gigamit sa pag-ilis sa enzymesolusyon para madeterminar ang OD660kay OD2, ΔOD=OD1-OD2.
6. L-tyrosine standard curve: 0.5mL lain-laing konsentrasyon L-tyrosine solution, 2.5mL Reagent III, 0.5mL Reagent IV sa 5mL centrifuge tube, incubate sa 37 ℃ sulod sa 30mins, detect for OD660alang sa lain-laing konsentrasyon sa L-tyrosine, unya nakuha ang standard curve Y=kX+b, diin Y mao ang L-tyrosine concentration, X mao ang OD600.
Pagkalkula
2: Kinatibuk-ang gidaghanon sa solusyon sa reaksyon (mL)
0.5: Dami sa solusyon sa enzyme (mL)
0.5: Ang gidaghanon sa likido nga reaksyon nga gigamit sa determinasyon sa chromogenic (mL)
10: Oras sa reaksyon (min)
Df: Dilution multiple
C: Konsentrasyon sa enzyme (mg/mL)
Mga pakisayran
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Biophys.Si Res.Komun.(1971);44:513.
3. Hilz, H.ug uban pa.,Eur.J. Biochem.(1975);56:103–108.
4. Sambrook Jet al., Molecular Cloning: Usa ka Laboratory Manual, ika-2 nga edisyon, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
Mga numero
Fig.1 Labing maayo pH
100mM buffer solution: pH6.0-8.0, Na-phosphate;pH8.0-9.0, Tris-HCl;pH9.0-12.5, Glycine-NaOH.Konsentrasyon sa Enzyme:1mg/mL
Fig.2 Labing maayo nga temperatura
Reaksyon sa 20 mM K-phosphate buffer pH 8.0.Konsentrasyon sa enzyme: 1 mg/mL
Fig.3 pH Kalig-on
25 ℃, 16 h-pagtambal nga adunay 50 mM buffer solution: pH 4.5- 5.5, Acetate;pH 6.0-8.0, Na-phosphate;pH 8.0-9.0, Tris-HCl.pH 9.0-12.5, Glycine-NaOH.Konsentrasyon sa enzyme: 1 mg/mL
Fig.4 Thermal kalig-on
30 min nga pagtambal nga adunay 50 mM Tris-HCl buffer, pH 8.0.Konsentrasyon sa enzyme: 1 mg/mL
Fig.5 Pagtipig lig-onty at 25 ℃
